'fences' een cel-migratie assay in 24 well kultuurplaten

Introductie
Het hier voorgestelde proefsysteem werkt met herbruikbare edelstaal-silikone delen ('fences') voor 24 well kultuur platen, die het de ingezette cellen slechts veroorloven om in een omschreven gebied te hechten. Zo staat er bij de start van de proef een cellaag met een gedefinieerde oppervlakte ter beschikking. (E.G. Fischer et al., 1980 J.Imunol.Meth. 128:235-239). Het proefssteem werd ontworpen om de expansie van celmonolayers van 'grote cellen' zoals endotheelcellen en fibroblasten, te onderzoeken. Het is niet geschikt voor granulocyten of andere bloedcellen. Door relatief geringe cel-ruimte-tijd benodigheden is het geschikt om gelijktijdig vele oplossingen te onderzoeken.
Het systeem wordt wereldwijd in vele onderzoeks-instituten ingezet om de monolayer expansie (migratie en/of proliferatie) onder de invloed van farmaca of oppervlakte eigenschappen van biomaterialen te onderzoeken. Voornamelijk wordt het gedrag van 'human umbilical vein endothelial cells' (HUVEC) en 'smooth muscle cells' (SMC) onderzocht. Voor de proef kunt U 24 well kultuur platen van vele firma's gebruiken.

Voordelen
Het proefsysteem is een verdere ontwikkeling van het oorspronkelijke systeem van Pratt et al. (1984, Am.J.Path. 117: 349-354) en Hasson et al. (1986, Surgery 100: 384-391). Bij de door deze autoren gebruikte grote ringen ontstonden problemen door het schending van de monolayer, en ook bij het behouden van de steriliteit. Ook plaatsgebrek limiteerde intensief gebruik. Deze nadelen worden hier middels nieuwe materialen en het gebruik van 24 well kultuurplaten overwonnen. Bovendien worden de oppervlakte problemen uitgesloten, zoals ze bij de 'wounded layer' techniek van Stenn (1980, In Vitro 16; 357-360) optreden. Wetenschappelijk niet verglijkbaar zijn systemen zoals de 'under-agarose assay' of de Boyden-kamer.

Methode
De 'fences' moeten na iedere proef (en voor de eerste) gereinigd en gesteriliseerd worden. Na de proeven, zo ook nu, moeten de 'fences' omgekeerd bewaard worden om het silikone te ontlasten. Voor de reiniging kan een laboratorium detergens, ethanol en een korte tijd (1-2 min) in een ultrasone bad gebruikt worden. De sterilisatie gebeurt het best bij 121°C (2 atm, vochtig); echter 180°C (1 atm, droog) is ook mogelijk, maar het silikone heeft er op den duur onder te lijden. Overigens is het silikone direct na de sterilisatie zeer kleverig, derhalve is het beter om de 'fences' ongeveer 1 uur na sterilisatie voor een proef te gebruiken om uw coating en de 'fences' te schonen.

Voor iedere proef worden de 24 well platen met de 'fences' samengesteld, en voor ongeveer 30 min in een incubator voorverwarmd, om o.a. het plakken van het silikone aan de oppervlakte te waarborgen.

In expansieproeven wordt de centrale boring (kamer) van iedere 'fence' met 150 µl medium, waarin zich b.v. 30.000 HUVEC cellen bevinden, gevuld. Bovendien wordt er voor de zekerheid de buitenste kamer met 650 µl medim (zonder cellen) gevuld, om een vloeistofval tussen de beide kamers te voorkomen. In 'wound closure' proeven worden omgekeerd 650 µl medium met b.v. 130.000 HUVEC cellen in de buitenste kamer en 150 µl medium zonder cellen in de centrale kamer gevuld. Vervolgens laten zich proeven voor cel-interactie plannen met verschillende cellen binnen en buiten.

Nadat de cellen voor b.v. 4-5 uren (bij HUVEC, andere celtypen soms langer) in de incubator de mogelijkheid hadden om zich aan de ondergrond vast te binden, worden de 'fences' met een pincet eruit gehaald en iedere well twee maal voorzichtig gespoeld (b.v. met PBS). Dan worden de wells met 1 ml medium (met/zonder de te onderzoeken oplossing) gevuld. Deze proeven dienen in drievoud of viervoud te geschieden. Hiermee begint de eigenlijke proef.

Om tussen proliferatie en migratie te kunnen onderscheiden kunnen de cellen nu met 15-25 Gy (1500-2500 rad) bestraald worden of er kan aan het medium een toxine (b.v. 10-20 µg/ml 5-Fluorouracil; in de literatuur tot 100 µg/ml) toegevoegd worden om de proliferatie te verhinderen.

De diameter van de cellaag bedraagt bij het begin van de proef 6,7 mm (afhankelijk van het celgedrag) welk met een oppervlakte overeenkomt van 35 mm². Na een incubatie van b.v. 5-7 dagen (bij HUVEC) met regelmatige mediumverversing (om de andere dag) heeft de cellaag zich vergroot. De proef kan nu beeindigd worden, door de cellen te fixeren (b.v. in ethanol-methanol (1:1) mix of met 5-10% paraformaldehyd oplossing in buffer voor 3-10 min). Na een spoeling worden de cellen gekleurd (b.v. met een 10% Giemsa oplossing gedurende 20 min), gevolgd door een ethanol spoeling voor max 1 min. Die door de cellen ingenomen oppervlakte kan nu visueel worden gemeten b.v met behulp van een mm raster (op folie gecopieerd mm papier) of met een raster in het oculair. Aangenamer is het om gebruik te maken van een computer-videosysteem welke de oppervlakte uitmeet.

Opmerking :
Na een tijdje verkleurt het silikone beigeachtig. Dit verouderingsproces beïnvloed de materiaaleigenschappen echter niet. Indien silikone deeltjes van het staal los zouden laten of ondicht worden, kunt U de fences beter niet meer gebruiken. Bewaart U a.u.b. de metalen delen, daar wij hieraan nieuwe silikone kunnen polymeriseren.

Cellen zouden niet gedurende meerdere dagen in den fences cultiveerd worden. De concentratie van metalionen kan op een waarde opkomen, die het gedrag van de cellen kan beinvloeden.

Ik hoop dat U met de assay goed overweg kunt. Neemt U gerust contact met ons op als wij U kunnen helpen.

P.S.: Laat het ons weten als deze tekst gecorrigeerd of aangevuld dient te worde.

Aanbieding
Voor onderzoeksdoeleinden kunt u bij ons een migratie assaykit (een set van 24 fences) verkrijgen tegen een prijs van € 430.oo (EURO) plus vrachtkosten en eventueel BTW of nationale douane.

  Telefon : +49 241 4500 358